Rev. chil. endocrinol. diabetes 2008; 1 (1)    Volver a Índice

 

Artículo Original

Variabilidad fenotípica y Estrés Oxidativo Endotelial en una familia con Hiperaldosteronismo Familiar tipo I

Carlos B. Stehr1*, Cristian A. Carvajal1a, Hernán Alcaíno3a, Patricia Lacourt2, Andreína Cattani2, Lorena M. Mosso1, Carlos E. Fardella1.

 

Phenotypical variability and Endothelial Oxidative Stress in a family with type I Familial Hyperaldosteronism

1Departamento de Endocrinología,

2Dpto. Pediatría, Unidad Endocrinología Infantil, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.

3Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.

a: Bioquímico

 

Correspondencia a: Carlos Fardella B. Departamento de Endocrinología Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. Lira 85, 5º piso Santiago-Chile. Teléfono: 056-02-354 3095. Fax: 056-02-638 5675. E-mail: cfardella@med.puc.cl

*Dr. Carlos Stehr se encuentra realizando residencia en Endocrinología con financiamiento de la Sociedad Chilena de Endocrinología y Diabetes.

 

Recibido el 11 de octubre, 2007.

Aceptado el 2 de noviembre, 2007.

Background: Type I familial hyperaldosteronism (HAF-I) is caused by the presence of a chimeric gene CYP11B1/CYP11B2 which encodes an enzyme with aldosterone synthetase activity regulated by ACTH. HAF-I patients present with severe hypertension at young ages and a greater risk of stroke. Aim: To characterize clinical and biochemical presentation of family members with HAF-I. To evaluate endothelial oxidative stress markers before and after glucocorticoid treatment. Patients and Methods: We evaluated three family members with HAF-I confirmed with a genetic test (XL-PCR) for chimeric gene CYP11B1/CYP11B2. The index case was a 13 years old boy with stage 2 hypertension (Joint National Committee VIIth report), plasma aldosterone/ plasma renin activity (AP/ARP) ratio of 161 and normal plasma potassium. His father had primary hyperaldosteronism diagnosed at 25 years of age with hypertension and hypokalemia. His sister was 15 years old, with a normal blood pressure and an AP/ARP ratio of 37.6. Results: All subjects had plasma xanthine-oxidase levels in the upper limit of normal. Malondialdehyde was above normal in the index case and his father. These markers returned to normal with glucocorticoid treatment. Conclusions: We report a HAF-I carrying family with a wide phenotypical variability between affected members. Elevation of endothelial oxidative stress markers and its normalization after glucocorticoid treatment, may indicate that aldosterone produces endothelial damage and increases cardiovascular risk.

Introducción

El hiperaldosteronismo primario (HAP) se debe a la producción autónoma de aldosterona por la zona glomerulosa de la corteza suprarrenal. Su secreción es independiente del eje renina angiotensina, por lo que en este tipo de pacientes se encuentran niveles de renina suprimida con aldosterona elevada. La hipertensión arterial en estos casos se debe a la acción de la aldosterona a nivel renal, aumentando la reabsorción renal de sodio, el volumen intravascular y, por lo tanto, la presión arterial1. La aldosterona produce efectos directos sobre varios órganos, describiéndose daño a nivel del corazón y endotelio, lo que podría traducirse en fibrosis miocárdica, reducción de la fibrinolisis y disfunción endotelial. En diferentes estudios se ha demostrado que los pacientes con HAP tienen más incidencia de hipertrofia ventricular izquierda y mayor cantidad de eventos cardiovasculares que los esperados para su nivel de presión arterial al compararlos con hipertensos esenciales2,4.

Investigaciones recientes señalan que la elevación de la aldosterona plasmática (AP) podría jugar un rol en la progresión de la enfermedad cardiovascular. Al combinarse la aldosterona con dieta rica en sodio se induce una respuesta vascular inflamatoria que es independiente de la elevación de la presión arterial. Esta respuesta se caracteriza por infiltración perivascular de leucocitos y remodelación vascular fibrinoide de la capa media vascular5.

Estudios en ratas con hipertensión arterial inducida por aldosterona mostraron aumento del estrés oxidativo endotelial (EOE) y de la respuesta génica secundaria a ésta, la cual fue sustancialmente abolida al administrar antagonistas del receptor de mineralocorticoides. En animales tratados con eplerenona se ha demostrado una disminución del EOE, grosor de la íntima e inflamación vascular6,7. Un marcador de EOE es la xantin-oxidasa, enzima encargada de catalizar el paso de hipoxantina a xantina. La elevación de esta enzima aumenta la producción de especies reactivas derivadas del oxígeno (EROS), con la consiguiente oxidación de moléculas a nivel endotelial, entre las cuales se encuentran los ácidos grasos8. Algunos productos de este fenómeno oxidativo pueden ser medidos, como lo es el malondialdehído, molécula derivada de la oxidación de ácidos grasos a nivel endotelial9,10.

Un modelo ideal para evaluar el efecto de aldosterona en estos marcadores lo constituye el hiperaldosteronismo primario familiar tipo I (HAF-I), ya que en estos pacientes el exceso de aldosterona se normaliza con el uso de glucocorticoides a diferencia de otras patologias, en las cuales solo es posible bloquear el efecto de aldosterona con el uso de espironolactona. Esto es asi porque en el HAF-I la produccion de aldosterona se encuentra bajo el control de la ACTH y, por lo tanto, es posible tratar administrando glucocorticoides.

El HAF-I se produce por una recombinacion desigual entre los genes que codifican para la 11s-hidroxilasa (CYP11B1) y la aldosterona sintetasa (CYP11B2), resultando un gen quimerico que tiene actividad de aldosterona sintetasa, pero regulado por ACTH11,13. Este gen quimerico contiene, en su porcion amino terminal, los elementos que determinan la respuesta a ACTH, fusionados a la secuencia codificadora del gen CYP11B2. Sujetos con HAF-I presentan hipertension arterial mas severa y una mayor incidencia de eventos vasculares cerebrales que pacientes portadores de HAP esporadico14. Sin embargo, se reporto en 1 familia italiana sujetos portadores del gen quimerico CYP11B1/CYP11B2 sin manifestaciones clinicas de hiperaldosteronismo15.

Recientemente, nuestro grupo detecto una familia en la cual tres de sus miembros son portadores de hiperaldosteronismo familiar tipo I. El objetivo del estudio fue caracterizar la presentacion clinica y bioquimica de familiares con HAF-I, evaluando ademas marcadores de EOE antes y a los 2 meses de iniciado el tratamiento especifico con glucocorticoides en estos pacientes.estos pacientes.

 

Pacientes y Metodos

Pacientes

El caso indice corresponde a un varon de 13 anos que consulto por hipertension arterial (HTA) 180/110 mmHg. El estudio de hipertension arterial secundaria demostro aldosterona plasmatica (AP) 48,4 ng/dL; actividad de renina plasmatica (ARP) <0,2 ng/mlEh y relacion AP/ARP 161,3, diagnosticandose hiperaldosteronismo primario. Potasio plasmatico (3,5 mEq/L) y TAC de suprarrenales normales. Se inicio tratamiento antihipertensivo con Nifedipino lograndose normalizacion de cifras tensionales (Tabla 1). A su padre se le diagnostico HAP a los 25 anos de edad en relacion a HTA etapa 2 (criterios JNC VII) e hipokalemia severa; actualmente en tratamiento con amiloride 20 mg c/12 h vo; AP 69,4 ng/dL; ARP 1,5 ng/mlEh; relacion AP/ ARP 46,2; potasio plasmatico normal (4,2 mEq/L); indice de masa corporal (IMC) 31,2 (Tabla 1). El caso indice tiene 2 hermanas, de 16 y 15 anos, siendo la hermana mayor solo por linea paterna. Ambas son normotensas y no tienen antecedentes morbidos de importancia. La hermana menor, de 15 anos, es eutrofica (IMC 22,8), destacando AP 11,3 ng/dL; ARP <0,2 ng/mlEh; relacion AP/ARP 37,6 y potasio plasmatico normal (4,1 mEq/L) (Tabla 1).

Para confirmar la existencia de un HAF-I se realizo estudio genetico para gen quimerico CYP11B1/CYP11B2 al caso indice y a 12 familiares directos, encontrandose afectados solo el caso indice, su padre y hermana de 15 anos (Figura 1), no pesquisandose la mutacion en otros integrantes de la familia.

En los 3 casos que se confirmo el diagnostico de HAF-I, se evaluo antes y a los 2 meses de iniciado el tratamiento con glucocorticoides: presion arterial, AP, ARP, potasio plasmatico, malondialdehido (MDA) y xantin-oxidasa (XO). Antes de iniciar los glucocorticoides se evaluo la edad osea, tanto en el caso indice como en su hermana. El tratamiento especifico se realizo con dexametasona en el padre (0,5 mg/dia vo) y hermana (0,25 mg/dia vo). En el caso indice, por encontrarse en periodo de crecimiento, se indico cortisol (10 mg/m2 superficie corporal, fraccionado en 3 dosis diarias) para evitar supresion del eje hipofisis suprarrenal y no interferir con la talla final. Se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes de acuerdo a las guias de la declaracion de Helsinki y la aprobacion del Comite de Etica de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Catolica de Chile.

Figura 1. Amplificación por XL-PCR de gen quimérico CYP11B1/CYP11B2 (GQ) y gen de la aldosterona sintetasa CYP11B2 (AS) en DNA de leucocitos de caso índice, padre, 2 hermanas y abuelos paternos. Columnas de derecha a izquierda: 1.- H20. 2.- Abuelo paterno. 3.- Abuela paterna. 4.- Padre. 5.- Hermana sana. 6.- Hermana portadora. 7.- Caso índice. 8.- Control negativo.

Financiamiento: Fondecyt Nº 1070876. Proyecto becado UC PG-11/07.


 

Metodos

Evaluacion bioquimica

La AP fue medida por radioinmunoensayo directo utilizando un kit comercial (Diagnostic Products, Los Angeles CA). La variacion intra e interensayo fue 5,1% y 7,1% respectivamente, siendo el valor normal de 1 a 16 ng/dL. La ARP fue evaluada por radioinmunoanalisis de Angiotensina I, obtenida por generacion enzimatica, kit comercial DIASORIN con variabilidad intra e interensayo de 6,1% y 6,6%, respectivamente. Su rango de normalidad se encuentra entre 1,3 y 4 ng/mlEh. El limite inferior de determinacion de ARP fue 0,2 ng/ mlEh. El potasio plasmatico fue medido por potenciometria indirecta-ion selectivo en equipo automatizado HITACHI, con limites de referencia entre 3,5-5,0 mEq/L.

Evaluacion de estres oxidativo endotelial

Los niveles plasmaticos de MDA fueron determinados por medio de la tecnica descrita por Castro et al.16. Se realizo una curva de calibracion con una solucion estandar de MDA (Merck) 100μM. Luego, a 300 μL de plasma se agregaron 200 μL de TCA 10% y 500 μL de TBA y se colocaron a bano maria durante 1 hora a 90oC. Luego de enfriar los tubos, se procedio a una centrifugacion de 3.500 x g durante 10 minutos a 4oC, y las absorbancias del sobrenadante se determinaron por espectrofotometria a 532nm. La concentracion de MDA se expreso en μM. Las variaciones inter e intraensayo fueron de 2,1% y 5,3%, respectivamente, siendo sus margenes de referencia entre 0,3 a 1,1 uM.

La actividad de XO en plasma se determino de acuerdo a la metodologia descrita por Prajda et al.17, en la cual se siguió, espectrofotométricamente a 290 nm, la formación de ácido úrico a partir de una solución de xantina. La actividad se expresó como unidades arbitrarias (UA) por mL de plasma, con un rango normal de referencia de 0,06 a 0,23 UA x ml-1 x min-1. Las variaciones inter e intraensayo fueron 6,5% y 5,2%, respectivamente.

Estudio genético

Se realizó siguiendo el protocolo descrito por Jonsson18. Se determinó la presencia del gen quimérico CYP11B1/ CYP11B2 y del gen de la aldosterona sintetasa CYP11B2. El DNA genómico se extrajo de leucocitos de sangre periférica. El DNA aislado de cada paciente fue sometido a 2 reacciones de amplificación realizadas simultáneamente mediante XL-PCR. En la primera reacción el primer sense (5´ TCC TTC ATC TAC CTT TGG CTG GGG 3´) es específico para la región 5´ del gen de la aldosterona sintetasa. En la segunda reacción el primer sense (5´TCA TGC ACC CCC AAT CAG TCC CTG 3´) es específico para la región 5´ del gen de 11ß-hidroxilasa. En ambas reacciones el primer antisense (5´GAG TCC TCC AGC TGC CTC TCA ACC 3´) es específico para la región del intron E del gen de la aldosterona sintetasa. Los primers están dirigidos contra regiones de la CYP11B1 y CYP11B2 que no son homólogas entre ellas, permitiendo la especificidad de la reacción. En cada reacción se incluyó un control positivo y otro negativo para confirmar la especificidad de la reacción. El producto de amplificación se visualizó en transiluminador- UV tras electroforesis en gel de Agarosa 0,8% con bromuro de etidio.

Resultados

Variabilidad fenotípica

El caso índice debutó con hipertensión arterial etapa 2 (JNC VII), sin hipokalemia, a diferencia de su padre, quien al momento del diagnóstico de hiperaldosteronismo primario presentaba hipertensión arterial etapa 2 (JNC VII) asociado a hipokalemia importante, la cual se corrigió con amiloride 20 mg c/12 hrs vo. La hermana, a pesar de ser portadora del gen quimérico CYP11B1/CYP11B2, tenía presión arterial y potasio plasmático normales.

Los tres pacientes al momento de la evaluación presentaban presión arterial y potasio plasmático normales, encontrándose el caso índice y su padre bajo tratamiento antihipertensivo. En el caso índice se observó una relación AP/ARP muy elevada, seguida en magnitud por la del padre y hermana (161, 3, 56, 2 y 37, 6 respectivamente) (Tabla 1). Tras 2 meses de tratamiento con glucocorticoides los pacientes persistieron normotensos, habiéndose suspendido el tratamiento antihipertensivo en el caso índice y en su padre. En este último se suspendió el amiloride, manteniendo el potasio plasmático normal. El padre y la hermana, que fueron tratados con dexametasona, normalizaron su AP (5,1 y 15 ng/dL), ARP (3,1 y 0,9 ng/ml·hr) y relación AP/ARP (1,64 y 17,3 respectivamente). En el caso índice se observó normalización de AP (8,7 ng/dL), persistiendo suprimida la ARP. La relación AP/ARP disminuyó a 29.

Tabla 1. Características clínicas y bioquímicas antes del tratamiento con glucocorticoides en pacientes con hiperaldosteronismo primario familiar tipo I.


Pº Art = Presión Arterial. IMC = índice de Masa Corporal. AP = Aldosterona plasmática. ARP = Actividad de Renina Plasmática.
K+= Potasio plasmático.

Marcadores de estrés oxidativo endotelial

En los tres pacientes estudiados se observó aumento en los marcadores de estrés oxidativo endotelial, variando la magnitud del aumento entre ellos. Los niveles de Malondialdehído se encontraron elevados en los 3 pacientes, siendo mayores en el caso índice y su padre (2,3 uM y 2,1uM, respectivamente) que en la hermana (1,5 uM). En todos los pacientes los niveles basales de xantin-oxidasa se encontraron en el límite superior del rango de referencia (Tabla 2).

Tras 2 meses de tratamiento con glucocorticodes se observó en los tres pacientes normalización de la aldosterona plasmática y de la relación AP/ARP sólo en el padre y en la hermana. En el caso índice la relación se mantuvo levemente elevada en relación a ARP suprimida. Los marcadores de estrés oxidativo endotelial se normalizaron con el tratamiento en todos los pacientes (Tabla 2).

Tabla 2. Marcadores de estrés oxidativo antes y 2 meses post inicio de glucocorticodes en pacientes con hiperaldosteronismo familiar tipo I.


Pº Art = Presión Arterial. AP = Aldosterona plasmática. AP/ARP = Relación Aldosterona plasmática/Actividad de Renina Plasmática. XO = xantin-oxidasa. MDA = Malondialdehído. VR = Valor de Referencia.

 

Discusión

Este estudio demuestra una gran variabilidad en la expresión fenotípica en sujetos portadores de HAF-I en una familia chilena. Además, encontramos una elevación de los marcadores de EOE que se normalizaron con la corrección de la aldosterona plasmática.

En relación al fenotipo, en esta familia encontramos que los pacientes portadores del gen quimérico CYP11B1/ CYP11B2 presentan variabilidad fenotípicas entre ellos. En el caso índice, la hipertensión arterial se inició a una edad temprana, sin presentar hipokalemia, mientras que su hermana 2 años mayor, es normotensa y solamente presenta evidencias bioquímicas de exceso de aldosterona. Su padre debutó con hipokalemia severa asociada a la hipertensión arterial. Este hecho ha sido comunicado por Fallo et al.15 en una familia italiana en la cual el padre del caso índice era normotenso a pesar de ser portador del gen quimérico CYP11B1/CYP11B2. La variabilidad fenotípica encontrada no puede ser explicada por factores ambientales como la alimentación o la ingesta de sodio, ya que los tres sujetos viven en el mismo hogar, no existiendo diferencias de este tipo entre ellos, a pesar de que el padre era obeso y los 2 hijos eutróficos. Otra explicación podría ser la existencia de penetrancia génica incompleta, dada por la presencia de genes protectores para el desarrollo de hipertensión arterial en la paciente afectada, pero normotensa.

Encontramos elevación de los marcadores de EOE en los tres pacientes (MDA, XO). Este hallazgo apoya la hipótesis de que la aldosterona es capaz de estimular directamente la producción a nivel del endotelio de EROS con el consiguiente aumento de XO9, produciéndose la oxidación de lípidos de membrana y el consiguiente aumento del MDA10.

Al tratar a los pacientes con glucocorticodes se observa que los dos que recibieron dexametasona normalizaron la AP, la ARP y la relación entre ellas. En el caso índice se normalizó la AP, manteniendo una relación AP/ARP levemente elevada. Este hecho se debe, probablemente, a que este paciente por encontrarse aún en etapa de crecimiento fue tratado con cortisol, el cual tiene menor vida media y menor efecto supresor sobre el eje hipotálamo-hipófisissuprarrenal. Este menor efecto supresor de ACTH no sería capaz de mantener la ARP en un nivel normal durante todo el día, pero sí lograría normalizar la AP, previniendo la exposición del endotelio vascular a concentraciones suprafisiológicas de aldosterona. Tras el tratamiento se observó disminución y normalización de los marcadores de EOE, aportando nueva evidencia sobre el efecto deletéreo de la aldosterona sobre el endotelio, el cual sería reversible al normalizar la aldosterona. El uso de glucocorticoides en estos pacientes no debería influir sobre la disminución del EOE, ya que los glucocorticoides ejercen su efecto anti inflamatorio actuando sobre la expresión de reguladores génicos como son el NF-kß y el activador de proteína 119. Éstos se encuentran involucrados en la respuesta inflamatoria en una etapa posterior a la formación de EROS y el aumento de xantin-oxidasa. Estudios experimentales han reportado un aumento en la expresión de xantin-oxidasa con el uso de dexametasona20.

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones, siendo la primera el bajo número de pacientes incluidos en la evaluación. El HAF-I corresponde a menos del 1% de los pacientes portadores de hiperaldosteronismo primario, teniendo una baja incidencia en la población general, lo que no permite obtener una casuística más extensa. Otra posible limitación es el corto período de tratamiento con glucocorticoides, sin embargo, en este tiempo se logró normalizar los marcadores de estrés oxidativo.

En conclusión, en este estudio pudimos observar una amplia variabilidad fenotípica en pacientes portadores de HAF-I, sugiriendo que este cuadro no siempre se presenta como una enfermedad grave. La elevación de los marcadores de EOE y su posterior normalización con el tratamiento del HAF-I aporta nueva evidencia sobre el posible mecanismo fisiopatológico por el cual la aldosterona produciría daño a nivel del endotelio y aumento del riesgo cardiovascular. Los resultados obtenidos deben ser confirmados en un estudio de mayor tamaño.

 

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