Introducción

La hipertensión arterial (HTA) es un problema de salud pública que afecta a 1,39 mil millones de personas en el mundo con una prevalencia del 31,1% y 27,6% en Chile1. En el 80% de los casos, la etiología de la hipertensión es desconocida, sin embargo, entre un 5-15% de estos hipertensos esenciales (HE), tendrían un cuadro de HTA secundaria a desórdenes endocrinos2. Entre ellos, se identifica el hiperaldosteronismo primario (HAP), el cual es una patología del sistema endocrino que tiene una prevalencia aproximada del 10% en la población HE3,4,5, y es la causa más frecuente de HTA secundaria. El HAP se caracteriza por una secreción inapropiada de aldosterona independiente de sus reguladores fisiológicos renina, angiotensina II y concentraciones de sodio6. El HAP es una condición patológica asociada a la activación del receptor mineralocorticoide (MR) por exceso de aldosterona circulante. Esta activación crónica del MR, aumenta el transporte de sodio y reabsorción de agua a nivel renal7, provocando una expansión del volumen sanguíneo que conduce a la elevación de la presión arterial8.

Actualmente el HAP se considera como una patología con un espectro fenotípico más amplio, donde es posible identificar formas subclínicas (incluyendo normotensos, correspondiente al 4% de los HAP), hasta fenotipos clínicos más severo o manifiestos con HTA, hipokalemia y una elevada razón aldosterona / actividad de renina plasmática (ARR)9,10. Los sujetos con HAP subclínico se caracterizan por no presentar manifestaciones clínicas evidentes (ej. presión arterial normal, normokalemia), sin embargo, tienen niveles renina suprimidos (<1 ng/ml*h) y elevación de aldosterona10,11,12, lo que se observa con una elevación de la ARR. Si bien el uso de la ARR ha contribuido significativamente al screening de individuos con HAP3, diversos factores como el género, la edad, etnicidad13, fármacos14, el método o técnica de laboratorio usado15 y la variabilidad intra-sujeto16, dificultan la correcta interpretación de este valor.

Junto con la importancia del diagnóstico de HAP por su asociación con aumento de la presión arterial, también se ha vuelto relevante debido a que altos niveles de aldosterona circulante presumen una activación excesiva del MR en tejidos extrarrenales, lo que produce efectos deletéreos independientes del aumento de presión arterial como inflamación, remodelamiento vascular y fibrosis, afectando al corazón17, el endotelio vascular18, el sistema inmune19 y el tejido adiposo20. A pesar de la alta prevalencia del HAP, los mecanismos que median los efectos deletéreos renales y extrarrenales del aumento de aldosterona más allá de la HTA, siguen siendo poco conocidos.

Recientemente se reportó que la expresión de la proteína orosomucoide-1 (ORM1), conocida también como glicoproteína acida alfa-1 (AGP1)21, podría estar regulada por elementos de la vía de regulación del MR22,23, proponiéndola como un atractivo biomarcador de la activación mineralocorticoide. ORM1 es una proteína de fase aguda sintetizada principalmente en el hígado que previamente ha sido reportada como un factor de riesgo cardiovascular24,25, y su expresión está bajo regulación tanto de citoquinas proinflamatorias (ej: TNF-α, interleucina (IL-1, IL-8, IL-11, IL-6) como de glucocorticoides26,27.

Por otro lado, la proteína NGAL (neutrophil gelatinase associated-lipocalin)28 es una glicoproteína perteneciente a la familia de las lipocalinas que participa en la regulación de variados procesos inflamatorios. NGAL es expresada en diferentes poblaciones celulares, incluyendo neutrófilos, riñones, endotelio, cardiomiocitos e hígado28,29. Esta proteína ha sido incluida como marcador en la evaluación de riesgo cardiovascular30, por su alto valor predictivo de enfermedad renal en pacientes con insuficiencia cardiaca31,32. Estudios in vitro han demostrado un aumento en la expresión de NGAL en células cardiacas estimuladas con aldosterona y su expresión podría estar regulada por el MR28,33. NGAL es capaz de formar un complejo estable y biológicamente activo con la Metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9), la cual está encargada de la degradación de la matriz extracelular, con lo cual evita su degradación y prolonga su actividad29. El aumento del complejo NGAL-MM9 ha sido asociado positivamente con el daño cardiovascular34.

En este sentido, el presente estudio busca evaluar la concentración de las lipocalinas ORM1, NGAL y el complejo NGAL-MMP9 en suero de sujetos HAP, para complementar y optimizar su diagnóstico.

Sujetos y Métodos

Se estudió una cohorte de 39 sujetos chilenos de similar estado socioeconómico y etnicidad, incluyendo sujetos de ambos sexos de entre 18-60 años. Todos los pacientes que participaron en el estudio firmaron un consentimiento informado de acuerdo con las guías de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile, bajo el certificado de aprobación CECMedUC 190823001 y 200619004.

Se clasificó los participantes según sus características clínicas y bioquímicas en 3 grupos: sujetos controles (CTL), hipertensos esenciales (HE) y sujetos con screening positivo de hiperaldosteronismo primario (HAP), los cuales fueron similares en género, edad e índice de masa corporal (IMC).

Todos los sujetos tuvieron una dieta de sodio ad libitum y declararon no realizar ninguna dieta extrema en el mes del análisis, ni consumir productos a base de hierbas. Se excluyó a los sujetos con enfermedad renal, insuficiencia hepática, insuficiencia cardiaca y diabetes mellitus. Se excluyó además a aquellos que estuvieran bajo tratamiento de glucocorticoides o anticonceptivos orales debido a sus efectos en la producción de hormonas adrenales14. Dado que gran parte de los pacientes hipertensos podrían estar recibiendo medicación antihipertensiva que afecte el sistema renina angiotensina aldosterona (RAAS) al momento del estudio, los antihipertensivos fueron reemplazados por amlodipino doxazosina por 15 días para el control de presión arterial.

Análisis Bioquímicos

Todos los sujetos del estudio cuentan con una ficha clínica donde se consignaron los datos más relevantes de la historia clínica y del examen físico. Se obtuvieron muestras de suero, plasma y orina. Se determinó la concentración de aldosterona en suero, actividad de renina plasmática (ARP), creatinuria, electrolitos plasmáticos y urinarios. La determinación de aldosterona y ARP se realizó mediante inmunoensayo utilizando kits comerciales (Coat-ACount Kit; Siemens, Los Ángeles, CA y DiaSorin, Stillwater, MN, respectivamente). La concentración de sodio y potasio en orina de 24 horas se evaluó mediante los métodos descritos previamente35. Todas las muestras de suero, plasma y orina se almacenaron a -80°C hasta el análisis.

Clasificación de los Sujetos

El grupo HAP se definió como sujetos con aldosterona en suero ≥ 9 ng/dL y ARP < 1 ng/mL*h acorde a las guías internacionales de HAP y la revisión de Vaidya et al7,9. El grupo HE se clasificó según las Guías Clínicas de Hipertensión Arterial del año 201736. El grupo Control se conformó por sujetos normotensos con parámetros clínicos y bioquímicos normales36.

Cuantificación de las proteínas ORM1 y NGAL

Las concentraciones de ORM1 se midieron mediante ELISA utilizando un kit comercial (DAGP00, R&D Systems, Inc, USA), al igual que las concentraciones de NGAL (DLCN20, R&D Systems, Inc, USA) y el complejo NGAL-MMP9 (DM9L20, R&D Systems, Inc, USA).

Datos y análisis estadísticos

Los datos de variables continuas se expresaron como mediana y rango intercuartil (Q2[Q1-Q3]). La diferencia entre el número de hombres y mujeres por grupo fueron analizadas por el test de χ2. La normalidad se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se utilizó el test de Kruskall-Wallis para análisis no paramétricos y un post test de Dunn. Todos los análisis estadísticos fueron realizados mediante el programa GraphPad Prism versión 9.0 y se consideró un p < 0,05 como significativo.

Resultados

El grupo control incluyó 13 sujetos, de los cuales 6 fueron hombres y 7 mujeres, el grupo HE incluyó 12 sujetos de los cuales 8 fueron hombres y 4 mujeres, y el grupo HAP incluyó 13 sujetos de los cuales 7 fueron hombres y 6 mujeres. En el grupo HAP, se observó mayor PAD (86 [76-95] vs 84 [81- 91] vs 75 [71-76] mmHg, p= 0,0003) y PAS (141 [129-153] vs 134 [123-139] vs 116 [110-121] mm Hg, p= 0,0005) que el grupo HE y control respectivamente (Tabla 1). El grupo HAP mostró una mayor concentración de aldosterona que el grupo HE (12.7 [10.4-13.7] vs 8.0 [6.6-8.7] ng/dL, p= 0,0019) y el grupo control (12.7 [10.4-13.7] vs 8.4 [6.4-11.9] ng/dL, p= 0,0149) (Figura 1a). Por otro lado, la ARP fue menor en el grupo HAP que en el grupo HE (0.8 [0.5-1.0] vs 1.7 [1.3- 2.5] ng/mL*h, p= 0,0001) y el grupo Control (0.8 [0.5-1.0] vs 1.7 [1.3-2.3] ng/mL*h, p= 0,0001) (Figura 1b). Cuando se comparó la ARR, se observó diferencias significativas entre el grupo HAP y el grupo HE (17.5 [13.1-20.1] vs 4.5 [3.0-6.3], p= 0,0001), y entre HAP y el grupo control (17.5 [13.1-20.1] vs 4.9 [3.1-7.0] p= 0,0001) (Figura 1c).

No se observó diferencias significativas en la concentración de electrolitos en sangre ni en muestras de orina de 24 horas, o de sus fracciones excretadas (Tabla 1).

Al determinar la concentración de la proteína ORM1 en suero se observó que el grupo HAP presentó una mayor concentración de ORM1 que el grupo HE (858,1 [59,2-1139] vs 62,5 [47,1-365,9] μg/mL, p= 0,01) y el grupo control (858,1 [59,2-1139] vs 88,0 [23,8-650,3] μg/mL, p= 0,0048) (Figura 2a).

No se observaron diferencias significativas en las concentraciones de NGAL (Figura 2b) ni del complejo NGALMMP9 (Figura 2c) en suero entre los grupos de estudio.

Se realizó un estudio de asociación de la concentración de ORM1 en suero, con parámetros clínicos y bioquímicos de tamizaje de HAP (Aldo sterona, ARP y ARR). Se observó una asociación positiva entre la concentración de ORM1 y la concentración de aldosterona (rho=0,33, p=0,05) y ARR (rho= 0,380 p= 0,021) (Figura 3). Por otro lado, se detectó una asociación negativa entre concentración de ORM1 con la ARP (rho= -0,407, p=0,012) (Figura 3). No se observó asociaciones significativas entre la concentración de ORM1 con ninguna otra característica clínica ni bioquímica (Tabla 1). No se observaron asociaciones significativas entre la concentración de NGAL con los parámetros clínicos y bioquímicos de la tabla 1 ni con ORM1.

Figura 1: Parámetros bioquímicos relevantes en el screening de hiperaldosteronismo primario en grupos HAP, HE y controles normotensos. a. Concentración de aldosterona en suero de los grupos Control, HE y HAP. Se observó diferencias significativas entre el grupo HAP y el grupo HE y el grupo control. b. Actividad de renina plasmática de los grupos Control HE y HAP (ng/mL*h). La ARP disminuye en los sujetos HAP en comparación a los HE y el grupo Control. c. Razón aldosterona/actividad de renina plasmática de los grupos Control, HE y HA. Cuando se utiliza la razón entre aldosterona/ARP, las diferencias entre grupos son mayores que al utilizar cualquiera de estos 2 por separado, observándose diferencias significativas entre el grupo HAP y el grupo HE y el grupo Control. Los datos se presentan como mediana y rango intercuartil [Q1-Q3]. *p< 0,05. **p< 0,01. ***p<0,0001. Análisis realizados mediante Kruskal-Wallis.

Figura 2: Concentración de NGAL, NGAL-MMP9 y ORM1 en suero en de sujetos HAP, HE y controles normotensos. a. Concentración sérica de NGAL en sujetos HAP, HE y Controles. No se observó diferencias significativas de la concentración de NGAL entre los grupos de estudio. Se observó un aumento significativo de la concentración de ORM1 en suero de sujetos HAP en comparación al grupo HE y Control. b. Concentración sérica del complejo NGAL-MMP9 en sujetos HAP, HE y Controles. c. Concentración sérica de ORM1 en sujetos HAP, HE y Controles expresado como log10. Se observó una relación similar a la concentración de NGAL libre, sin diferencias de la concentración de NGAL-MMP9 entre los grupos de estudio. Los datos se presentan como mediana y rango intercuartil [Q1-Q3]. *p< 0,05. **p< 0,01. Análisis realizados mediante Kruskal-Wallis.

Figura 3: Mapa de calor de la asociación entre la concentración de ORM1, Aldosterona sérica, ARP y ARR en sujetos HAP, HE y controles normotensos. Las asociaciones positivas se reportan en tonalidades azules con el respectivo valor de ρ (rho) dentro de cada casilla. De igual forma se reportan las asociaciones negativas en tonalidades rojas. Se observó asociaciones significativas entre la concentración sérica de ORM1 con las 3 variables bioquímicas más relevantes en el screening de HAP. Todos los estudios de asociación se realizaron mediante el test de Spearman para variables no paramétricas, p < 0,05.

Tabla 1. Características clínicas y bioquímicas de los sujetos según grupo.

Tabla resumen de parámetros clínicos y bioquímicos relevantes en el diagnóstico de hiperaldosteronismo primario de los 39 sujetos que comprende el estudio, clasificados en 3 grupos de individuos normotensos sanos (Control), Hipertensos esenciales (HE) y con screening positivo de hiperaldosteronismo primario (HAP). Los datos se presentan como mediana y rango intercuartil [Q1-Q3]. PAS: Presión Sistólica; PAD: Presión Diastólica; ARP: Actividad de renina plasmática; ARR: Razón Aldosterona/ARP; FEK: Fracción Excretada de Potasio. a Diferente del grupo control. b Diferente del grupo HE. Análisis realizados mediante Kruskal-Wallis, p < 0,05 y prueba de χ2, p < 0,05.

Discusión

En el presente estudio, se evaluó la concentración de las lipocalinas ORM1, NGAL y el complejo NGAL-MMP9 en suero como potenciales biomarcadores de sospecha diagnóstica de HAP. En ellos observamos una mayor concentración de ORM1 en suero en comparación con el grupo HE y Control (Figura 2a). Además, demostramos por primera vez una asociación positiva entre la concentración de ORM1 y la aldosterona plasmática, y también una asociación negativa con ARP (Figura 3). Ambos resultados son consistentes con la sospecha clínica de HAP, el cual estaría asociado a un mayor estado inflamatorio y a una activación de MR. A la fecha no existen publicaciones que asocien a ORM1 con parámetros bioquímicos de tamizaje de HAP. En este sentido, la diferencia de concentración de ORM1 entre los sujetos HAP vs HE (Figura 2) y su asociación con aldosterona, ARP y la ARR (Figura 3) incluso utilizando un tamizaje “permisivo” de HAP9, sugiere que la medición de esta proteína en sangre podría ser útil en la sospecha diagnóstica de HAP tanto clínica como subclínica (ej. en ausencia de aumento de la presión arterial o HTA).

Recientemente demostramos el aumento de ORM1 en vesículas extracelulares urinarias en sujetos con HAP mediante análisis proteómicos21. Los resultados del presente estudio son concordantes con ese reporte, sugiriendo que la medición de ORM1 tanto en suero como en EVs podría ser candidato como biomarcador temprano de HAP. ORM1 es una proteína de fase aguda asociada a riesgo cardiovascular, cuyo aumento en circulación se ha reportado en varias enfermedades37,38,39. Junto con ello, se ha descrito que el promotor del gen de ORM1 contiene regiones de unión a elementos regulatorios de la vía mineralocorticoide como MRE y Sp122,40 y que su expresión disminuye en presencia de antagonistas del MR como espironolactona41, sugiriendo que ORM1 podría ser un interesante biomarcador subrogado (“surrogate biomarker”) de la activación mineralocorticoide.

Similar a lo comentado para ORM1, diversos autores han reportado la proteína NGAL como un marcador de daño renal33,42,43,44,45 y un potencial marcador de la actividad mineralocorticoide33,46. En el presente estudio, no se observó diferencias significativas en la concentración sérica de NGAL ni NGAL-MMP9 entre los sujetos HAP, HE y Controles (Figura 2b y 2c). Como tampoco se observaron asociaciones significativas con variables críticas de HAP, como aldosterona, ARP y la ARR. Estudios previos han reportado que el promotor del gen de NGAL contienen regiones que son capaces de unirse al MR y que la expresión de NGAL estaría regulada por este receptor33. Sin embargo, otros factores estarían involucrados en la regulación de los niveles de NGAL, tal como el factor nuclear Kappa-B (NF-kB)47. Reportes previos han descrito una regulación antagónica a nivel transcripcional entre MR y NF-kB48, y cómo el desbalance entre estos dos factores (especialmente a nivel cardiaco) puede alterar la expresión de NGAL, reflejando que la regulación en los niveles plasmáticos de esta proteína sería compleja33. En esta misma publicación, el equipo de Laouche et al, observó que la infusión directa de aldosterona en murinos es incapaz de aumentar los niveles circulantes de NGAL, puesto que el incremento en los niveles de esta proteína sólo ocurre en ratones sometidos a nefrectomía, infusión de aldosterona y dieta rica en sal (NAS “challenge”)33. Otro reporte por Sun et al. revela que el tejido adiposo visceral sería también importante en los niveles y efectos de NGAL circulante en condiciones fisiopatológicas49. Basados en estos reportes, sugerimos que el aumento de NGAL y NGAL-MMP9 en sujetos con identificados como HAP puede ser multifactorial y su rol como potencial biomarcador en formas subclínicas de HAP es discutible. La exploración a futuro de los niveles de NGAL total podrían revelar quizás alguna asociación.

Dentro de las limitaciones del presente estudio se debe considerar que ninguno de los sujetos clasificados como HAP cuenta con una prueba confirmatoria, ya sea de sobrecarga salina, captopril o fludrocortisona, lo cual sería interesante evaluar a futuro en esta u otra cohorte de sujetos.

En conclusión, reportamos una mayor concentración de ORM1 circulante en sujetos con screening positivo de HAP, lo que concuerda con lo observado previamente en vesículas extracelulares urinarias21 y modelos animales de HAP. La asociación de ORM1 con parámetros bioquímicos de tamizaje de HAP, apoyan la utilidad de ORM1 en el desarrollo de un algoritmo diagnóstico de formas clínicas y subclínicas de HAP.

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