Introducción

El cortisol es una hormona de la familia de los glucocorticoides, sintetizada en la corteza de la glándula suprarrenal. Entre un 70-80% es transportado en sangre unida a la globulina transportadora de cortisol (CGB), un 15% se encuentra unido a albúmina y entre un 5-10% circula libre, y es la fracción biológicamente activa. Además, esta fracción libre es capaz de traspasar la barrera endotelial, acumulándose en otro tipo de fluidos biológicos, como la orina o saliva1-3.

Fisiológicamente el cortisol presenta variaciones en su concentración plasmática durante el día. Posee un ritmo circadiano, donde los valores más altos de esta hormona se encuentran entre las 7:00-8:00 AM y decrecen durante el día hasta llegar a los valores mínimos entre las 23:00-24:00 h. Debido a estas variaciones es esencial estandarizar un horario de toma de muestras, y tener rangos de referencia según el momento del día en que se toma dicha muestra4,5.

Existen diferentes técnicas para medir cortisol pero la medición de la fracción de cortisol libre presente en el plasma refleja el cortisol biológicamente activo y por lo tanto, es una mejor aproximación que medir el cortisol total sanguíneo. Además, al presentar los valores más bajos durante la noche (23 a 24 h) la medición de cortisol nocturno permite detectar la pérdida del ciclo circadiano tempranamente, por lo que sería el mejor examen para evaluar si un paciente presenta alteraciones en su ciclo circadiano3,6,7.

Los exámenes de laboratorio que miden la fracción de cortisol libre son: cortisol libre en orina de 24 h (CLU) y el cortisol libre en saliva8-11. La medición de CLU es de mucha utilidad en el diagnóstico de SC, estima la producción de cortisol en 24 h, pero involucra la recolección de orina durante todo un día, por lo tanto, depende de la adecuada recolección por parte del paciente y de la diuresis final. En el laboratorio se realiza una extracción y posterior concentración del cortisol libre presente en la muestra. En contraste, la medición del cortisol en saliva tiene muchas ventajas, principalmente su fácil recolección y transporte al laboratorio; no involucra la extracción de sangre venosa, y por consiguiente, se evita el estrés que puede elevar el resultado. El paciente puede recolectar su saliva mediante un instructivo en su hogar, los dispositivos permiten obtener un volumen adecuado de muestra y mayor comodidad para su procesamiento y almacenamiento en el Laboratorio.

El síndrome de Cushing (SC) es un trastorno endocrino caracterizado por altos niveles de cortisol, ya sea endógeno o por administración de corticoides. Uno de los primeros hallazgos en los pacientes que padecen SC endógeno es la pérdida del ciclo circadiano del cortisol. Los valores en sangre de los pacientes tienden a ser constantes durante el día, o bien no disminuyen significativamente6. La utilización del cortisol salival nocturno, ha resultado muy útil en el diagnóstico de SC independientemente de la etiología; enfermedad de Cushing, SC adrenal o tumores ectópicos12,13.

A pesar de que la concentración de cortisol en saliva es 10 veces más baja que en el plasma14, estudios muestran que existe una estrecha correlación entre el cortisol libre en saliva y el cortisol sérico15-17, así como el cortisol libre urinario11,15,18. Zhang y colaboradores realizaron una recopilación de datos publicados entre el año 1998-201219. Se estimó una sensibilidad promedio para el diagnóstico de SC de 95,3% y especificidad de 91,62%, demostrando mucha utilidad diagnóstica.

Por otra parte, los límites de referencia son muy variados dependiendo de la población y técnica en que se usa16,19-23. Según distintos autores internacionales, los valores de 0,52 ug/dL (14,2 nmol/l); 0,4 ug/dL (11,0 nmol/L) y 0,31 ng/dL (8,56 nmol/L) este último de un estudio local, podrían con alta probabilidad, discriminar entre sujetos sanos y con Síndrome de Cushing15,21. Estas diferencias hacen necesario evaluar los rangos referenciales según el método y población en el laboratorio de diagnóstico.

Para la cuantificación de cortisol libre en saliva se han utilizado diferentes técnicas: radioinmunoensayo (RIA), Enzimoinmunoensayo (EIA)2,24, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (Gold standard) 25-28 y más recientemente electroquimioluminiscencia (ECLIA)15,18,20,26.

Entre las ventajas del ECLIA se encuentran la automatización, el bajo volumen de muestra a utilizar y un menor costo por determinación. Actualmente el equipo Cobas e411 de la empresa Roche tiene en el mercado kits para determinar cortisol en saliva. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar cuál de los valores de corte descritos en la literatura, es representativo de nuestra población.

Sujetos y Métodos

El estudio se realizó en el Laboratorio de Endocrinología y Biología de la Reproducción del Hospital Clínico Universidad de Chile. Se reclutó a 75 voluntarios de ambos sexos, entre 18-75 años, con los siguientes criterios de exclusión: índice de masa corporal mayor a 35 kg/m2, padecer enfermedades crónicas como diabetes, enfermedad hepática o renal crónica, epilepsia, cáncer; o enfermedades psiquiátricas como depresión, bipolaridad, crisis de pánico, etc.; fumar más de 3 cigarrillos al día o padecer alcoholismo, embarazo, uso de antimicóticos orales los últimos 3 meses o tratamiento con corticoides en el último año, cualquier enfermedad aguda en las últimas dos semanas y turnos o actividades nocturnas en la última semana.

Además, se contó con 5 muestras de individuos diagnosticados con Síndrome de Cushing. Todos los voluntarios firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico Universidad de Chile y recolectaron dos muestras de saliva durante dos días consecutivos entre las 23:00 y 24:00 h, mediante los dispositivos Salivette®. Se entregó a cada voluntario un instructivo que contenía los requisitos para una toma de muestra adecuada: enjuagar boca y manos con agua fría antes de manipular el dispositivo Salivette®, no realizar ejercicios vigorosos durante dos horas previas a la toma de muestra, comer y cepillar los dientes hasta una hora antes de ésta y mantener las muestras de saliva a 4°C hasta su transporte al Laboratorio. Las muestras se centrifugaron a 2.500 rpm por 10 min y se congelaron a -20°C hasta su procesamiento por el equipo automatizado de electroquimioluminiscencia Cobas e411 (Roche). El rango dinámico de la técnica va desde 0,018 hasta 63,4 ug/dL de cortisol y se utilizó el suero control Preci-control universal (Roche) como control de calidad interno.

Se excluyeron los valores de una voluntaria a quien se le diagnosticó embarazo ectópico reciente, y cuyos valores se encontraban notoriamente alterados, con respecto al resto de los voluntarios. Los datos se presentan como promedio ± desviación estándar. Para estos cálculos se consideró el promedio de las dos tomas de muestras de los sujetos y se utilizó t-test para comparar los valores de cortisol salival nocturno tomados el día 1 y 2 por los voluntarios.

Resultados

Participaron 75 voluntarios de entre 18 y 61 años; 41 de sexo femenino (34,5 ± 13,2 años e IMC 24,8 ± 3,9) y 34 de sexo masculino (31,4 ± 9,5 años e IMC 25,4 ± 3,8) que cumplieron con los criterios de inclusión. El promedio de valor de cortisol libre salival nocturno de los voluntarios fue de 0,165 ± 0,059 ug/dL con un rango de 0,082-0,352 ug/dL (Figura 1). Además, en el estudio se contó con la medición de cortisol salival nocturno de 5 individuos diagnosticados con Síndrome de Cushing, los que tuvieron un promedio de 3,94 ± 6,94 ug/dL con un rango de 0,343-16,335 ug/dL.

No se encontraron diferencias significativas al analizar los valores de cortisol entre día 1 y día 2 de los individuos controles. El valor promedio de cortisol salival 23 h de los voluntarios el día 1 fue 0,165 ± 0,076 y el día 2 fue 0,163 ± 0,068. Las diferencias entre el valor del día 1 y 2 se agruparon (Figura 2) y resultó que en el 88,9% de los individuos, los valores fueron similares (con diferencias menores a 0,059 ug/dL o bien menores a una desviación estándar del grupo), sólo en el 2,8% de los casos existieron diferencias mayores a 0,177 ug/dL.

Discusión

El cortisol en saliva nocturno es una determinación fácil y no invasiva que apoya al diagnóstico y seguimiento del Síndrome de Cushing8,9,15,18,25,29,30. También ha demostrado ser útil para el seguimiento de pacientes con SC episódico o cíclico y en incidentalomas suprarrenales12, donde los pacientes presentan alzas de cortisol episódicas. La ventaja del cortisol salival en estos casos radica en que se pueden tomar muestras durante varios días o un período de tiempo prolongado, lo que permite monitorear fácilmente las variaciones de cortisol libre2. Existen además, evidencias que promueven la medición de cortisol libre para discriminar entre pacientes con SC y pacientes pseudo-cushing y también en el seguimiento de pacientes post-terapia31.

Sin embargo, el rango de normalidad para el cortisol salival es técnica-dependiente y población dependiente20. Existen diversos rangos de referencias y límites de cortes en la literatura internacional, por lo que es necesario establecerlo para cada población y para la técnica utilizada en la detección.

Los valores de cortisol salival nocturno obtenidos en esta muestra de voluntarios concuerdan con los resultados publicados previamente por nuestro grupo21. En dicho trabajo se sugiere un límite de corte para cortisol saliva nocturno de 0,31 ug/dL y los resultados del actual trabajo refuerzan este planteamiento. A pesar de que el número de pacientes con Síndrome de Cushing mostrados en este trabajo es bajo, todos presentaron valores elevados y sobre 0,31 ng/dL, diferenciándose claramente del grupo control. La literatura propone diferentes puntos de corte para la determinación de cortisol salival nocturno. La Tabla 1 muestra algunos límites de corte publicados, y la especificidad que tendrían si se aplicaran a la muestra de nuestra población.

Para Chile el rango sería concordante con los estudios de Lépez y Carrasco, por lo que se podría proponer un rango de normalidad de hasta 0,32 ug/dL, ya que al aumentar el valor de corte a 0,35 ug/dL, alcanza el valor que registró uno de los cinco voluntarios con SC (0,342 ug/dL). Sería interesante contar con más pacientes con SC para establecer la zona gris entre éstos y los voluntarios sin SC.

Según nuestros resultados, a pesar de que la mayoría de los participantes no tienen diferencias significativas entre las mediciones del día 1 y 2, un 20,7% presenta diferencias entre las dos mediciones mayores a 1 desviación estándar, principalmente por la toma de muestra inadecuada. Por lo que tomar 2 mediciones, sería útil para descartar que un aumento se deba a errores en el procedimiento de toma de muestra o no seguimiento de las instrucciones. Existen muchos factores que pueden alterar la concentración de cortisol plasmático o bien su ritmo circadiano. Entre estos están el estrés, ejercicio, medicamentos, dieta, alteraciones prolongadas del sueño o de ciclos de luz-oscuridad11. Otro factor es la globulina transportadora de cortisol (CBG) que en ciertas situaciones (pacientes con terapia estrogénica o embarazo11 aumenta y por consiguiente, aumenta el cortisol total medido en sangre. Esto puede llevar a interpretaciones equivocadas frente a la sospecha de hipercortisolismo, por lo que es necesario para el correcto diagnóstico, contar con la medición de la fracción libre del cortisol, cuyos niveles se mantienen constantes.

Es importante considerar además, que aparte de la variación circadiana del cortisol, existe evidencia de variaciones en su concentración sérica asociadas a edad y sexo. Estas diferencias fluctuarían entre 20-50% del valor de cortisol plasmático entre los 20 y 80 años de edad. También se ha descrito que las mujeres pre-menopásusicas tienen en promedio niveles más bajos que los hombres de su mismo grupo etario4.

Las principales desventajas de la toma de muestra de saliva son que el paciente no recolecte una cantidad adecuada de la muestra, que no siga las instrucciones o pueda alterar la matriz de la muestra: ingerir alimentos en el momento de la toma de muestra, realizar ejercicios vigorosos o fumar, pueden alterar los niveles de cortisol, o que al enjuagar la boca previo a la toma de muestras, no salive lo suficiente y exista efecto de dilución. En cuanto al almacenamiento de la muestra, luego de ser recolectada la saliva en el dispositivo se debe mantener a 4°C hasta su transporte al Laboratorio (Se recomienda transportar con cadena de frío). Como el cortisol, es una hormona esteroidal, de mucha estabilidad química, no es sensible a la degradación por cambios de temperatura ambiental. No se han registrado variaciones en los valores de muestras almacenadas a 4°C hasta por 3 meses32, pero sí existe una disminución cercana al 10% por mes, cuando las muestras son mantenidas a temperatura ambiente. Sin embargo, se sugiere que la muestra sea almacenada a -20ºC si no es procesada inmediatamente33 hasta por 28 días. En el caso de querer almacenar las muestras por un tiempo prolongado, existen trabajos que describen que no hay cambios significativos en la concentración de cortisol en las muestras almacenadas a -20°C o -80°C hasta por un año32.

El kit de EIA Salimetrics es bastante usado en la literatura disponible para medir cortisol en saliva15,34, pero al ser un kit de medición ultrasensible, tiene la desventaja de cuantificar sólo hasta 3 ug/dL de cortisol (valor correspondiente al estándar de concentración más alta) dificultando el informe de resultados en el laboratorio asistencial, ya que habría que realizar diluciones de los valores más altos para ser informados. Por otro lado, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa es la técnica gold-estándar para la medición del cortisol libre en diferentes fluidos, incluyendo la saliva26,35,36. Un estudio norteamericano28 sugiere que el límite de corte para discriminar individuos sanos y con Síndrome de Cushing es 0,107 ug/dl (2,95 nmol/L) (Zerikly et al. 2010). Este punto de corte es mucho más bajo que los obtenidos a través de las otras técnicas, reforzando la idea que los resultados son técnica-dependiente. Lamentablemente, no todos los laboratorios cuentan con esta técnica analítica, debido a los elevados costos del equipamiento y funcionamiento. El método de ECLIA tiene una buena correlación con los métodos manuales antes descritos y la técnica gold-standard, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa37. Un estudio Tailandés16 determinó que los resultados de cortisol salival nocturno en individuos sanos, obtenidos mediante ECLIA tienen una estrecha correlación con los resultados obtenidos a través del kit de EIA Salimetrics: 0,34 ± 0,016 ug/dL en comparación a 0,38 ± 0,018 ug/dL por EIA. Además, el método de ECLIA fue más preciso que el método manual, ya que éste obtuvo un coeficiente de variación inter-ensayo de 6,48% en comparación al 14,36% EIA.

En conclusión, podemos decir que la medición de cortisol en saliva es una herramienta útil para el diagnóstico de SC, siempre que el paciente siga adecuadamente las instrucciones de toma de muestra. El límite de corte entre pacientes con y sin SC de 0,32 ug/dL sería adecuado para esta técnica y en nuestra población.

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