Introducción

La Prolactina (Prl) es una hormona polipeptídica sintetizada en las células acidófilas de la adenohipófisis; circula en varias formas moleculares de diferentes tamaños: a) “Prl monomérica”, nativa o pequeña de 23 kDa, bioactiva y con gran afinidad a su receptor, que constituye aproximadamente el 85% de la PRL circulante en individuos normales; b) “Prl grande” de 50-70 kDa que puede ser Prl glicosilada o compuesta por dímeros de la nativa y que representa 10-15% del total; c) "Prl grande-grande o Macroprolactina” de PM > 100 kDa, que es principalmente un complejo con IgG, pudiendo también constituirse por agregación de Prl nativa; esta forma es biológicamente inactiva y tiene vida media más prolongada. En individuos hiperprolactinémicos, la proporción relativa de estas formas circulantes puede ser considerablemente diferente1.

En algunos, la Prl puede estar mayoritariamente en forma de macroprolactina (macro Prl), lo que debe considerarse “pseudo-hiperprolactinemia” sin trascendencia clínica2, dado que no se asocia a tumor hipofisiario y tampoco induce supresión del eje hipotálamo–hipófisis–ovario. Esto avala lo importante que es identificar adecuadamente la macro Prl para evitar procedimientos diagnósticos y terapéuticos inadecuados y costosos. Por ello, algunos laboratorios efectúan la detección rutinaria de macro Prl en los sueros hiperprolactinémicos, considerando que la presencia de macro Prl es probablemente la causa más común de error de diagnóstico y tratamiento inadecuado en los pacientes con hiperprolactinemia2.

Los actuales inmunoensayos usados para la detección de Prl presentan diversos grados de reactividad con macro Prl, diferencias que se explican probablemente en la disímil reactividad cruzada de los anticuerpos3,4. A pesar de que algunos metodos dicen tener una baja reactividad cruzada con macro Prl, hay literatura que contradice esta afirmacion5. Lamentablemente, no hay un metodo sencillo y automatizado para la deteccion de macro Prl y la gran mayoria de los laboratorios chilenos no ofrecen un procedimiento para esta deteccion. El metodo ggold standardh para la deteccion y confirmacion de macro Prl es la cromatografia de filtracion en gel (GFC) que consiste en la separacion de las distintas formas moleculares de acuerdo al peso molecular de ellas. Este es un metodo laborioso, de alto costo y poco practico para laboratorios clinicos de alta demanda y que necesitan respuesta rapida; por esto, se han desarrollado tecnicas alternativas, como la de precipitacion con polietilenglicol y la separacion por ultrafiltracion5, que permiten determinar en forma indirecta la eventual presencia de macro Prl en la muestra.

El objetivo de este estudio fue evaluar comparativamente las tecnicas de precipitacion con polietilenglicol (PEG) y de separacion por ultrafiltracion (UF) para la determinacion de macro Prl en muestras propias de la rutina de un laboratorio clinico.

Sujetos, Material y Metodos

Muestras

Se escogieron 57 sueros anonimos de las muestras guardadas a -20 oC en que se solicito determinacion de Prl (53 mujeres, edad .. } DE = 32 } 13 anos y 4 hombres, edad .. } DE = 37 } 18 anos). Las muestras se dividieron en 3 grupos segun al valor de Prl (11 sueros . 18 ng/mL, 13 sueros > 18 ng/mL y < 30 ng/mL, y 32 sueros . 30 ng/mL). Cada muestra fue descongelada, homogenizada y separada en tres alicuotas: una para medir Prl, otra que fue tratada con una solucion al 25% de PEG y la tercera para ser ultrafiltrada.

Ensayo de Prl

La determinacion de Prl fue realizada en el autoanalizador ADVIA Centaur (Siemens Diagnostics). Este es un inmunoensayo tipo emparedado de dos puntos que utiliza tecnologia quimioluminometrica directa, y cantidades cons.tantes de dos anticuerpos. Los valores de referencia son dependientes de la edad y sexo de los pacientes, con un valor superior normal para adultos hombres de 20 ng/mL y 25 ng/mL para mujeres. Los coeficientes de variacion intra e interensayo son < 5,5% a valores de 3,3 a 118 ng/mL. El ensayo mide concentraciones de Prl de hasta 200 ng/mL, con una sensibilidad analitica de 0,3 ng/mL. La formula de conversion provista por el ensayo es 1 ng/mL = 21,2 ƒÊUI/mL.

Ensayo de precipitacion con Polietilenglicol (PEG)

Se mezclan 200 ƒÊL de suero con igual volumen de una solucion acuosa al 25% de PEG 6.000 (SIGMA, cat. P2263). Se agitan vigorosamente por 2 min y se incuban a temperatura ambiente durante 10 min. La suspension se centrifuga a 10.500 g por 15 min; el sobrenadante recuperado se diluye 1:3 con multidiluyente 1 (provisto por el ensayo de Prl del ADVIA Centaur, Siemens) para la determinacion de Prl. Los resultados de Prl del sobrenadante, despues de la correccion por dilucion, se comparan con los resultados de Prl obtenidos a partir del suero no tratado y se expresan como el porcentaje de recuperacion de Prl.

Ensayo de ultrafiltracion (UF)

Se utilizo el dispositivo comercialmente disponible Millipore Amicon Ultra-4 (cat. UFC810096) con un punto de corte de 100 kDa. Se agregan 250 uL de suero junto a 250 uL de NaCl 0,9% a temperatura ambiente. Luego se centrifuga a 4.000 g por 20 min. La determinacion de Prl se realiza en el ultrafiltrado y su concentracion corresponde a Prl de PM < 100 kDa. Estos resultados se compararon con los obtenidos a partir del suero no tratado y se expresaron como el porcentaje de recuperacion de Prl.

Se considero como nivel significativo de macroprolactinemia aquel que muestra una recuperacion de Prl inferior al 40% en el sobrenadante, despues de la precipitacion con PEG o en el ultrafiltrado. Los resultados se expresaron como porcentaje de recuperacion.

Resultados

Las muestras analizadas presentaron valores de Prl que fluctuaron entre 4,5 y 411 ng/mL. Los porcentajes de recuperacion posterior al tratamiento con PEG y UF fueron independientes de la concentracion inicial de Prl. Los resultados obtenidos en 56 de las 57 muestras analizadas se observan en la Tabla 1. Se excluyo una muestra debido a que presentaba una recuperacion muy baja de Prl comparado con lo encontrado normalmente en la literatura para macro Prl, (6% con PEG y 13% con UF) con valor inicial de PRL de 54 ng/mL (ver Discusion).

Al separar las muestras de acuerdo a si la recuperacion era mayor o menor al 40% se encontro concordancia entre ambos metodos en 55 de las 56 muestras analizadas, presentando 7 de ellas recuperacion < 40% por precipitacion con PEG y 8 por UF. La muestra discordante presento una recuperacion por precipitacion con PEG de 51% y de 38% por UF. Al dividir las muestras de acuerdo al valor de la concentracion inicial de Prl se encontro una recuperacion bajo el punto de corte de < 40% en los tres rangos evaluados; la muestra discordante entre ambos metodos correspondia a una Prl de 53 ng/mL (Figura 1). Si consideramos solo las muestras con valores de Prl > 30 ng/L, se observa que 3 de 32 presentaron recuperacion < 40% cuando se trataron con PEG y 4 de 32 cuando se realizo UF. Los valores de Prl y recuperaciones de estas muestras se presentan en la Tabla 2.

Al comparar los porcentajes de recuperacion en cada muestra segun las dos tecnicas, se observa que la precipitacion con PEG tiene mayor dispersion de los valores que la UF permitiendo una mejor separacion de las muestras. (Figura 2).

Discusión

Estos resultados demuestran que los porcentajes de recuperación de Prl fueron independientes de los valores iniciales de Prl y que un 12,5% de las muestras analizadas con la técnica PEG y 14,3% con la técnica UF presentaron recuperación de prolactina < 40%, sugerente de la presencia de macro Prl. Con las técnicas de precipitación con PEG y UF sólo se puede hablar de porcentaje de recuperación y no se puede determinar el porcentaje de macro Prl, debido a que su precipitación así como su separación por UF, es inespecífica. En este estudio no fue posible comprobar la presencia de macro Prl en los sueros analizados debido a la escasez de la muestra y a la falta de disponibilidad de la técnica GFC.

La mayoría de los estudios anteriores han demostrado que recuperaciones menores del 40% determinan confiabilidad respecto de la presencia de importantes cantidades de macro Prl y que recuperaciones de más del 50% señalan la ausencia de macro Prl, con un área gris en las recuperaciones entre el 40 y el 50% que requerirían GFC para confirmar o refutar la presencia de macro Prl. Otros han sugerido que las muestras con recuperación entre 30 y 65% deberían ser clasificadas como indeterminadas y requieren efectuar GFC para un diagnóstico definitivo2,6-8. En las muestras analizadas, sólo un pequeño número de pacientes pertenecían a esta categoría “gris”, con 7 de los 56 pacientes en la cohorte con recuperaciones menores al 40% con precipitación con PEG y 8 con UF. Si consideramos sólo las muestras con valores de PRL > 30 ng/mL, se observa que un 12,5% (4 de 32) y un 9,4% (3 de 32) de los sueros post PEG y UF, respectivamente, tenían una recuperación < 40%, haciendo importante investigar la presencia de macroprolactinemia en dichas muestras.

Está claramente demostrado que el ensayo de precipitación con PEG no es específico para la eliminación de macro Prl, ya que las Prl grandes y alrededor de un 20% de la Prl monomérica pueden quedar atrapadas en el precipitado. El carácter no específico de la precipitación con PEG es una de las principales limitaciones de la técnica, ya que podría confundir una hiperprolactinemia causada sólo por presencia de macro Prl de una hiperprolactinemia real en que puede haber además, presencia de macro Prl2. Un ejemplo de la precipitación inespecífica podría ser la muestra excluida de los análisis en que la extremadamente baja recuperación de Prl (6% con PEG y 13% con UF), pudiera explicarse por el hecho de que se encontró aumento en la fracción gama en la electroforesis de proteínas de esa muestra. En este caso, la Prl monomérica sería co-precipitada por gammaglobulinas con PEG y la cantidad de Prl precipitada está relacionada con la concentración de globulinas del suero; así las altas concentraciones de globulinas pueden ser una causa de baja recuperación de Prl después de la precipitación con PEG y llevar a la errónea interpretación de que se está en presencia de macro Prl9. Por otro lado, puede haber interferencia en algunos inmunoensayos para la determinación de Prl post precipitación con PEG, hecho que es importante considerar al momento de implementar la determinación de macro Prl.

No obstante, la precipitación con PEG es simple, rápida y de bajo costo para la detección de macro Prl y se correlaciona bien con cromatografía de filtración en gel, por lo que resulta ser un método conveniente con buena relación costo-efectividad como tamizaje, donde una recuperación de PRL en el sobrenadante < 40%, sugiere la presencia de macroprolactina2. El método de UF es bastante sensible para la detección de macro Prl ya que separa las isoformas de Prl de acuerdo al peso molecular y puede ser especialmente valioso cuando PEG interfiere en algunos ensayos; sin embargo, tiene como inconveniente el alto costo económico10.

Al comparar las técnicas de precipitación con PEG y UF para detectar la presencia de macro Prl, se encontró una buena correlación entre ellas cuando se consideraba una recuperación < 40% como punto de corte para diferenciar hiperprolactinemia de macroprolactinemia; sin embargo, la precipitación con PEG permite una mejor diferenciación de los pacientes que la UF, lo que la hace muy apropiada para la búsqueda de macro Prl en casos de hiperprolactinemia asintomática, ya que trabaja con una escala más amplia, lo que redundaría en mayor sensibilidad para la pesquisa. Dado lo anterior, se ha favorecido al ensayo de precipitación con PEG como el mejor método para la detección de macro Prl y ha sido ampliamente adoptado para este fin11.

En resumen, estos resultados demuestran que alrededor de un 10% de las muestras con Prl > 30 ng/mL presentaban valores de recuperación de Prl < 40%, sugerentes de la presencia de macro Prl, lo que avala el uso más extendido e incluso rutinario de alguna de estas técnicas en pacientes con hiperprolactinemia. La precipitación con PEG permite la detección de macro Prl en forma fácil y con un costo razonable, permitiendo su implementación como técnica de uso habitual en un laboratorio clínico. Sin embargo, los autores consideran que la determinación de macro Prl no debe realizarse automáticamente, sino que debe estar sujeta a la solicitud expresa del médico tratante.

Referencias

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