Introducción

El zinc (Zn) es un micronutriente esencial y fundamental para el ser humano y otros organismos, donde este tiene una importante participación en el metabolismo del ADN (síntesis y transcripción), estabilización de proteínas, y en la actividad de más de 300 enzimas vinculadas directamente a procesos celulares tales como la división celular y la apoptosis1,2. Además, el Zn es relevante para la mantención de un adecuado: i) estado redox intracelular; ii) respuesta inmunológica; iii) señalización celular; iv) función endo y exocrina pancreática y v) reparación de tejidos3. Siendo el Zn un micronutriente relevante en el metabolismo, cualquier alteración en su homeostasis puede generar diversas alteraciones y/o el desarrollo de diversas patologías entre las que destaca la diabetes. En este sentido, en 1938 se reportó por primera vez que los niveles de Zn en cadáveres de pacientes diabéticos eran un 50% menores en comparación a los cadáveres pacientes no diabéticos, sugiriendo una asociación entre la concentración de Zn y la diabetes tipo 1 y 24. Además, en pacientes con diabetes el Zn en orina aumenta significativamente5-7. En la diabetes tipo 2, también se ha observado una disminución significativa en los niveles plasmáticos de Zn8,9, lo que puede indicar un deterioro en los niveles de Zn asociados directamente a la enfermedad. A diferencia de la diabetes tipo 2, en la diabetes tipo 1 el Zn plasmático tiende a aumentar, probablemente como resultado de la destrucción de las células β-pancreáticas, produciéndose un incremento en el aporte de Zn a la sangre10,11. La diabetes tipo 2 es una compleja patología que puede presentar: i) resistencia a la insulina y/o ii) una disminución en la secreción de insulina, donde el Zn participaría principalmente en la preservación de la capacidad de liberar insulina. El Zn se encuentra en importantes concentraciones en los islotes pancreáticos y participa en la conversión de proinsulina en insulina y en la cristalización de insulina para su posterior liberación, lo que demuestra claramente la importancia del Zn en el metabolismo de esta hormona12,13. Por otra parte, la insulina en presencia de Zn se puede asociar en hexámeros, estructuras más estables que facilitan su liberación al torrente sanguíneo, indicando la importancia del Zn para un correcto procesamiento, almacenamiento y liberación de la insulina14.

El Zn se secreta en forma conjunta con la insulina, y de hecho la hipersecreción de insulina puede agotas las reservas de Zn en las células β-pancreáticas15. Pero las funciones del Zn en el páncreas no sólo se limitan a las células β-pancreáticas, dado que la suplementación con Zn en ratones db/db permitió reducir los niveles de glucosa e insulina en ayuna16. En ratas diabéticas suplementadas con Zn se observó una disminución significativa en el deterioro generado en la retina por el estrés oxidativo característico de la diabetes17. Además, en ratas tratadas previamente con aloxano o dithiozone (agentes tóxicos a nivel pancrático) se observó que la suplementación con Zn permitió prevenir la hiperglicemia y la destrucción de los islotes pancreáticos18. El Zn es un micronutriente fundamental para múltiples procesos en el organismo, además de presentar una serie de efectos beneficiosos frente a la diabetes, sin embargo, los mecanismos asociados a estos efectos aún son desconocidos. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del estímulo con Zn sobre la liberación de insulina en el modelo celular MIN-6.

Material y Método

Cultivo celular y estímulo con Zn

Las células de la línea celular pancreática MIN-6 (ATCCTM, University Boulevard, Virginia, U.S.A.) fueron mantenidas en un medio Eagle modificado Dulbecco´s (DMEM, Life Technologies) el cual contenía glucosa (2,8 mM) suplementada con solución de suero fetal bovino al 15%, β-mercaptoetanol (5μL/L), penicilina (100 unidades/ mL), y estreptomicina (100 μg/mL) a 37°C en una atmósfera con 95% aire y 5% CO2. Las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos a una densidad de 3 x 105 células/mL, creciendo durante la noche a un 80% de confluencia. Previo al estímulo con Zn se realizaron pruebas de viabilidad celular determinando las dosis máximas posibles de utilizar. Las células fueron lavadas con buffer fosfato salino e incubados por 0, 6, 12 y 24 horas a 37°C en 0,5 mL de un medio que contenía sulfato de Zn (ZnSO4) en diferentes (0; 0,25; 0,5 y 1 μM), utilizándose como control para determinar niveles basales de insulina un medio que no contenía Zn (ZnSO4).

Medición de los niveles de insulina

Después del estímulo con Zn las células MIN-6 fueron incubadas por 30 minutos en una solución con glucosa (2,8mM) más un de buffer de BSA KRBH al 0,5% (NaCl 129,4 mM; KCl 5,2 mM; CaCl2 2,7 mM; KH2PO4 1,3 mM; MgSO4 1,3 mM; NaHCO3 24.8 mM; y HEPES 10 mM a pH 7,4) y luego niveles de insulina (ng/mL) fueron determinados por triplicado en tres ensayos independientes mediante un kit ELISA ultrasensible (Mercodia, Carolina del Norte, USA).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como el promedio ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó con el test de mediante Kruskal-Wallis, seguido de comparación entre todos los grupos.

Resultados

En este modelo celular el estímulo con Zn (ZnSO4) en los diferentes tiempos (0, 6, 12 y 24 horas) y concentraciones utilizadas (0; 0,25; 0,5 y 1 μM) mantuvo la viabilidad de la línea celular pancreática MIN-6, donde en ninguno de los tiempos y concentraciones utilizadas se presentó una disminución significativa en los niveles basales de insulina (p > 0,05) (Tabla 1). Al evaluar el posible incremento en los niveles basales de insulina liberados por las células MIN-6 sólo el estímulo con Zn a las seis horas con una concentración de 0,25 μM generó un incremento significativo en los niveles de insulina (p < 0,05) en comparación con los otros grupos experimentales (tiempo y dosis) (Tabla 1).

Discusión

El páncreas es un órgano que tiene un importante contenido de Zn, el cual se ubica principalmente en los islotes pancreáticos, y modificaciones en los niveles intracelulares de Zn libre se producen en respuesta a estímulos externos, tales como un aumento en las concentraciones plasmáticas de glucosa19. En las células β-pancreáticas el Zn es esencial para el correcto procesamiento, almacenamiento y secreción de insulina20 y la concentración de Zn aumenta considerablemente en los gránulos donde se almacena la insulina para su posterior secreción, permitiendo establecer que el Zn, está involucrado en el metabolismo, almacenamiento y tiempo de acción de la insulina21. Además el Zn actúa como un inhibidor de la secreción de glucagón, de hecho la secreción de Zn durante la hiperglicemia, parece ser una señal para las células α-pancreáticas supriman la secreción de glucagón22. En las células, el contenido de Zn además de estar estrictamente regulado, sus concentraciones varían significativamente, siendo la concentración intracelular de Zn libre del orden pico a nano molar, mientras que en plasma en contenido de Zn total es del orden micromolar. A nivel celular de Zn esta estrictamente regulado por dos familias de transportadores, la familia ZnT (SCL30A), donde su función es exportar Zn al espacio extra celular o incorporar Zn a determinados compartimentos celulares, reduciendo así los niveles citoplasmáticos de Zn23. Y la familia ZIP (SLC39A), cuya función es importar Zn al intracelular o sacar Zn de determinados compartimentos celulares, aumentando la concentración citoplasmática de Zn24. En este sentido uno de los transportadores de Zn, específicamente el transportador SLC30A8 (ZnT8), el cual se expresas en monocitos y células pancreáticas25 puede ver alterada su expresión tanto en la tanto en el caso de la diabetes tipo 1 como la tipo 2, situación atribuida a niveles elevados de citoquinas proinflamatorias, lo que además de repercutir en el metabolismo celular del Zn, alteraría la liberación de insulina, estableciendo la relevancia del Zn en el metabolismo de la insulina26. Los resultados obtenidos en este estudio estimulan a la realización de nuevas investigaciones sobre el efecto del Zn sobre la liberación la insulina, considerando los cambios en i) los niveles intracelulares de Zn; ii) interacción entre el Zn con otros agentes o moléculas asociadas al metabolismo de la insulina; iii) modificaciones moleculares de los transportadores de Zn y iv) el potencial uso de la suplementación con Zn humanos como parte del tratamiento de la diabetes27.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Sra. María Luisa Aravena Santolaya, bioestadística Pontificia Universidad Católica de Chile, su contribución en el análisis estadístico de los resultados y al Dr. Patricio Contreras por facilitarnos la última edición del Andrology Male Reproductive Health and Dysfunction.

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